本附錄規定了用培養法定性測定集中空調系統冷卻水、冷凝水及其形成的沉積物、軟泥等樣品中的嗜肺軍團菌，其他洗浴水、溫泉水、景觀水等樣品中的嗜肺軍團菌測定可參照執行。

 

B.2 術語和定義

　　下列術語和定義適用于本方法。

　　B.2.1

　　嗜肺軍團菌  legionella pneumophila

　　樣品經培養在GVPC瓊脂平板上生成典型菌落，并在BCYE瓊脂平板上生長而在L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板不生長，進一步經生化實驗和血清學實驗鑒定確認的菌落。

 

B.3 儀器和設備

　　B．3.1 平皿：Φ90 mm。

　　B．3.2   CO2培養箱：35℃～37℃。

　　B．3.3  紫外燈：波長360 nm±2 nm。

　　B．3.4 濾膜過濾器。

　　B．3.5  濾膜：孔徑0. 22 μm~0. 45 μm。

　　B．3.6 真空泵。

　　B．3.7 離心機。

　　B．3.8 渦旋振蕩器。

　　B．3.9 普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡。

　　B．3. 10 水浴箱。

　　B．3. 11  廣口采樣瓶：玻璃或聚乙烯材料，磨口，容積500 mL。

 

B.4 培養基和試劑

　　B．4,1  GVPC瓊脂平板。

　　B．4.2  BCYE瓊脂平板。

　　B．4.3  BCYE-CYE瓊脂平板。

　　B．4.4 革蘭氏染色液。

　　B．4.5  馬尿酸鹽生化反應管。

　　B．4.6 軍團菌分型血清試劑。 

 

B．5 采樣

　　B．5.1 將廣口采樣瓶（B．3.11）用前滅菌。

　　B．5.2  每瓶中加入Na2S203溶液（c=0.1 mol/L）O.3 ml_～0.5 mL，中和樣品中的氧化物。

　　B．5.3 水樣采集位置：冷卻水采樣點設置在距塔壁20 cm、液面下10 cm處，冷凝水采樣點設置在排水管或冷凝水盤處。

　　B．5.4 每個采樣點依無菌操作取水樣約500 mL。

　　B．5.5 采集的樣品2d內送達實驗室，不必冷凍，但要避光和防止受熱，室溫下貯存不得超過15 d。

 

B.6 檢驗步驟

　　B．6.1  樣品的沉淀或離心：如有雜質可靜置沉淀或1000 r/min離心1 min去除。

　　B．6.2 樣品的過濾：將經沉淀或離心的樣品通過濾膜（B．3.5）過濾，取下濾膜置于15 mL滅菌水中，充分洗脫，備用。

　　B．6.3 樣品的熱處理：取1 mL洗脫樣品，置50℃水�。˙．3.10）加熱30 min。

　　B．6.4 樣品的酸處理：取5 mL洗脫樣品，調pH至2.2，輕輕搖勻，放置5 mm。

　　B．6.5 樣品的接種：取洗脫樣品（B．6.2）、熱處理樣品（B．6.3）及酸處理樣品（B．6.4）各0. 1 mL，分別接種GVPC平板（B．4.1）。

　　B．6.6  樣品的培養：將接種平板靜置于CO2培蕎箱（B．3.2）中，溫度為35℃-37℃，CO：濃度為2. 5%。無CO2培養箱可采用燭缸培養法。觀察到有培養物生成時，反轉平板，孵育10 d，注意保濕。

　　B．6.7 菌落觀察：軍團菌生長緩慢，易被其他菌掩蓋，從孵育第3天開始每天在顯微鏡（B．3．9）上觀察。軍團菌的菌落顏色多樣，通常呈白色、灰色、藍色或紫色，也能顯深褐色、灰綠色、深紅色；菌落整齊，表面光滑，呈典型毛玻璃狀，在紫外燈下，部分菌落有熒光。

　　B．6.8 菌落驗證：從平皿上挑取2個可疑菌落，接種BCYE瓊脂平板（B．4.2）和L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板（B．4.3），35℃～37℃培養2 d，凡在BCYE瓊脂平板上生長而在L一半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板不生長的則為軍團菌菌落。

　　B．6.9 菌型確定：應進行生化培養與血清學實驗確定嗜肺軍團菌。生化培養：氧化酶（-／弱+），硝酸鹽還原（-），尿素酶（-），明膠液化（+）．水解馬尿酸。血清學實驗：用嗜肺軍團菌診斷血清進行分型。